AGENTES ETIOLÓGICOS DE INFECCIONES DE PEZONES Y MASTITIS INFECCIOSAS

Juan Miguel Rodríguez Gómez

Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Universidad Complutense de Madrid, 28040 Madrid

Correo electrónico: jmrodrig@vet.ucm.es

1. Introducción

Desde un punto de vista microbiológico, los estudios sobre leche materna, tanto en mujeres sanas como en mujeres con problemas infecciosos, son muy escasos y, en general, obsoletos (Ford et al., 1977; Gavin y Ostovar, 1977). Precisamente, uno de los principales obstáculos para el análisis microbiológico de muestras procedentes de mujeres con infecciones de pezones y/o mastitis de posible etiología infecciosa es el desconocimiento de los microorganismos que se encuentran de forma natural (es decir, en ausencia de infección) en la leche y los pezones. La presencia de una micro biota integrada por diversas especies de bacterias lácticas (incluyendo entero cocos), estreptococos, estafilococos, propionibacterias e, incluso, algunas entero bacteriáceas, no sólo no es negativa sino que juegan papeles biológicos muy importantes para la correcta colonización del intestino y la maduración del sistema inmunológico infantil, lo que redunda en una protección del lactante frente a enfermedades infecciosas (Heikkila y Saris, 2003; Martín et al., 2003; 2005).

De hecho, el potencial prebiótico de las bacterias presentes en la leche materna debería ser un motivo de reflexión para los Bancos de Leche. El desconocimiento de la existencia de una micro biota específica en la leche materna ha propiciado que estas entidades desechen aquellas leches que contienen un recuento total de entre 103 y 105 ufc/ml, a pesar de que dichas concentraciones se encuentran de forma natural en la leche de prácticamente cualquier mujer sana (Milk Banking Association of Norte América, 1993). Además, la mera presencia, a cualquier nivel, de entero cocos, estafilococos o bacterias Gram.-negativas también se considera un elemento de inaceptabilidad. En los últimos años, el empleo de medios de cultivo y de técnicas moleculares ha revelado que tales bacterias son habitantes naturales de la leche materna por lo que, siguiendo ese criterio, prácticamente ninguna mujer sana debería amamantar a su bebé; afortunadamente, a las mujeres que amamantan directamente a sus hijos no se les practica cultivos de leche materna. En este sentido, no es de extrañar que hasta un 86% de las muestras de leche extraídas de mujeres chinas sanas habría sido rechazada según los criterios de muchos Bancos de Leche (Ng et al., 2004) a pesar de que, en ese mismo estudio, el empleo de esa leche “presuntamente contaminada” derivó en efectos beneficiosos para la salud de los niños que la consumieron, especialmente en comparación con la de aquellos que recibieron fórmulas infantiles.

Habitualmente, en las infecciones que afectan a la mama suele existir uno o más factores que propician el predominio de entre una y cuatro cepas con los factores de virulencia necesarios para causar síntomas clínicos. A diferencia de lo que se suele pensar, en una proporción muy elevada de estas infecciones, los agentes etiológicos implicados no proceden de la piel (que resulta un ecosistema bacteriano relativamente pobre) sino de otras mucosas de la madre, lactante u otras personas del entorno materno, ya sea por vía exógeno u endógena. La denominación de algunas especies, como Staphylococcus epidermidis o Propionibacterium acnes, suele hacer pensar al personal médico que su ecosistema natural o único es la piel; sin embargo, lejos de ser así, el ecosistema natural de esas especies y de otras afines es el tracto intestinal y, especialmente, el intestino grueso, donde las condiciones existentes realmente favorecen su desarrollo.

2. Análisis de muestras presuntamente infecciosas

2.1. ¿Qué muestras hay que coger?

En la mama, los problemas infecciosos pueden ser superficiales o intramamarios. Las infecciones superficiales suelen estar circunscritas a los pezones y areola mamaria, y se las suele conocer como “infecciones de pezones”. En estos casos, los agentes etiológicos pueden proceder de prácticamente cualquier fuente en el entorno cercano de la mujer (su propia piel, una contaminación de origen intestinal o naso-faringe, la boca y manos del niño o cualquier otro elemento del ambiente que la rodea). En estos casos, conviene utilizar un hisopo estéril para la recogida de la muestra. El hisopo se pasa por la superficie del pezón, especialmente por las zonas más afectadas, ejerciendo una ligera presión. Es conveniente recoger muestra de los dos pezones aunque aparentemente sólo esté afectado uno de ellos. Obviamente, es necesario un hisopo por cada pezón (nunca utilizar el mismo hisopo para los dos pezones). También es recomendable que el hisopo se emplee en seco, sin la ayuda de agua o una solución salina, ya que, curiosamente, el empleo de hisopos húmedos conduce a un peor arrastre de microorganismos y puede complicar el diagnóstico microbiológico.

En el caso de las mastitis intramamarias, los agentes causales suelen proceder del las mucosas internas de la propia madre y llegan a la glándula mamaria a través de la circulación sistémica. Si la micro biota normal de la leche materna está alterada y/o existe cualquier otro factor que altere la fisiología de la lactancia, estos microorganismos no sólo predominan sobre los demás sino que los acaban desplazando por completo. De esta manera, se produce una auténtica situación de disbiosis y el/los agentes) causales) colonizan por completo los acinos y los conductos galactóforos. Generalmente, este hecho conduce a un proceso inflamatorio que, ocasionalmente, puede derivar en abscesos y en estasias de la leche. En estos casos, hay que recoger una muestra de leche. Pero, ¿qué muestra de leche? ¿Las primeras gotas? ¿un chorro después de eliminar el inicial?. Nuestro grupo ha comparado los recuentos obtenidos en las primeras gotas y en chorros intermedios en 30 ratonas, 15 cerdas y 10 mujeres lactantes (5 sin ningún problema y 5 con infección de pezones o mastitis infecciosa) y el análisis estadístico de los datos obtenidos demuestran que no existen diferencias significativas.

2.2. ¿Cómo se deben recoger las muestras?

El proceso que recomendamos para la obtención de muestras, independientemente de que se sospeche de una infección de pezones o de una mastitis intramamaria, es el siguiente: en primer lugar, obtener un hisopo del pezón del pecho no afectado (o menos afectado) y, después, una muestra de leche de ese mismo pecho. A continuación, se debe repetir el proceso con el pecho afectado (o más afectado). Todas las muestras se deben recoger en un envase estéril y sin previo tratamiento de los pechos/pezones con ninguna sustancia antiséptica ni con ninguna preparación antibiótica tópica ya que podrían desvirtuarse los resultados. Lo ideal sería recoger la muestra a primera hora de la mañana (antes de una toma) o, si no es posible, tras cualquier periodo más o menos prolongado desde la última toma (y siempre antes de la siguiente). La muestra se puede recoger mediante expresión manual, previo lavado de las manos y uñas con agua templada/caliente y jabón y secado con una toalla limpia o con una toallita de un solo uso. También se puede extraer con bomba, siempre que esté perfectamente desinfectada/esterilizada. En caso de dudas sobre el estado de la bomba, es preferible recurrir a la expresión manual.

En cualquier caso, cuando la sintomatología que presenta una mujer pudiera estar relacionada con un proceso infeccioso, sería recomendable hacer un diagnóstico microbiológico preciso lo más precozmente posible. Nunca olvidar que es importante tomar muestras de ambos pechos incluso en el caso de que parezca que sólo está afectado uno de ellos.

Además, es importante señalar que, en ciertos casos, la presencia de microorganismos patógenos puede no ir acompañada de sintomatología y provocar un proceso infeccioso realmente importante en el lactante. Este hecho, se ha observado en unidades neonatales con microorganismos que raramente se asocian a las clásicas mastitis de lactancia, como Salmonella typhimurium (Qutaishat et al., 2003) o Serratia marcescens (Jones et al., 2000). Paradójicamente, la mayor parte de los agentes que causan infecciones de pezones o mastitis infecciosas clínicas no suelen ejercer un efecto negativo en los lactantes (ocasionalmente, eritema de los pañales) y es posible que esta sea una de las cusas que expliquen (pero no justifiquen) la escasa atención que han recibido tradicionalmente. Realmente, si el proceso fuera doloroso y molesto para el lactante, en vez de para la madre, actualmente se conocería mucho mejor su etiología y tratamiento. El hecho de que tampoco se trate de un problema económicamente relevante (las madres recurren con frecuencia a aguantar el dolor lo mejor posible y/o a remedios caseros) es el otro gran argumento que explica porqué se ha investigado tan poco un proceso infeccioso relativamente frecuente.

3. Etiología de las infecciones que afectan a la mama

Los microorganismos que, con diferencia, se aíslan con mayor frecuencia en los distintos procesos infecciosos que afectan a las mamas pertenecen al género Staphylococcus. Se suele considerar a S. áureos como la especie más representativa en estos procesos; aunque ese parece ser el caso, no hay que subestimar la importancia de otras especies y, muy particularmente, S. epidermidis. Conviene señalar que los procedimientos clásicos para identificación de estafilococos no son adecuados para la diferenciación entre estas dos especies, con lo que la incidencia de S. epidermidis podría haber sido infravalorada. El segundo grupo bacteriano en orden de frecuencia está constituido por diversas especies del género Streptococcus. Menos comunes son los casos atribuidos a especies de la Familia Enterobacteriaceae, como Escherichia coli o Salmonella, o a Mycobacterium tuberculosis. Finalmente, algunas levaduras también pueden estar implicadas en estos procesos. La especie prototipo es Cándida albicans aunque su importante como agente etiológico en estas infecciones ha sido tradicionalmente sobredimensionado (Carmichael y Dixon, 2002). Para una revisión sobre los casos existentes en la bibliografía y los agentes etiológicos implicados se puede consultar la monografía “Mastitis. Causas y manejo” publicada por la OMS en el año 2000.

Los resultados obtenidos en nuestro laboratorio indican que, en ciertos caso, la infección tiene una etiología múltiple, destacando las combinaciones estafilococos-estreptococos, estafilococos-cándidas, estafilococos-estreptococos-cándidas y cualquiera de las anteriores con entero bacteriáceas. En estos casos resulta particularmente un diagnóstico completo ya que el tratamiento que se instaure puede eliminar a algunas de las especies responsables de la infección pero no necesariamente a todas, lo que conduce a una selección de las especies resistentes y una agudización de los síntomas.

Quizás, el resultado más destacable del análisis de las muestras que hemos recibido hasta la fecha haya sido la identificación de nuevos agentes causantes de infección de pezones y/o mastitis intramamarias que no habían sido descritos hasta la fecha. Entre ellos destacan los siguientes:

• Janibacter limosus

• Microbacterium trichotecenolyticum

• Brachybacterium conglomeratum

• Raoultella terrigena

• Micrococos luteus

4. Métodos de análisis microbiológico

En la actualidad coexisten diversas técnicas para el estudio de los microorganismos existentes en ecosistemas relativamente complejos (Tabla 1). A continuación, se describen las principales características y aplicaciones de aquellas que han alcanzado mayor difusión.

4.1. Métodos tradicionales directos

Tradicionalmente el estudio de la micro biota humana se ha abordado fundamentalmente a través del cultivo de los microorganismos y su identificación mediante pruebas fenotípicas clásicas: morfológicas, fisiológicas y bioquímicas. El cultivo de las muestras biológicas en medios selectivos y diferenciales es, en apariencia, el método más simple y directo; sin embargo, no posee una alta fiabilidad debido a la existencia de bacterias no cultivables. Además, la existencia de especies (o cepas) sensibles al oxígeno obliga a procurar estrictas condiciones reductoras durante el procesado y cultivo. El análisis directo mediante recuento microscópico suele ser complementario para controlar la eficacia de la metodología de cultivo. Sin embargo, presenta el inconveniente de que no proporciona información de la diversidad microbiana y los recuentos pueden también infravalorarse si las bacterias tienden a unirse y formar agregados.

Por lo que respecta a las bacterias más frecuentemente asociadas a infecciones mamarias, entre los medios más adecuados (pero no únicos) para su crecimiento cabe destacar los siguientes:

• Staphylococcus spp.: Baird-Parker, CNA

• Streptococcus SP.: CNA

• Otras Micrococáceas y grupos afines: CNA

• Entero bacteriáceas: VRBA, VRBGA, MC Conkay, TBA

• Cándida SP. y otras levaduras: Cándida, Chromogenic Cándida, Sabouraud Dextrose

En todos los casos, la temperatura de incubación debe ser 37ºC, a excepción de los medios para levaduras y mohos que, paralelamente (es decir, además de a 37ºC), se deben incubar a 24ºC durante 7 días. Para el resto de los medios, un tiempo de incubación de 48 h debería ser más que suficiente. Es importante recalcar que ningún medio es completamente selectivo y, por ejemplo, no debe bastar la observación de colonias negras en placas de Baird-Parker para diagnosticar S. áureos. El/Los microorganismos) aislados) deben) identificarse preferentemente mediante secuenciación de su DNA, un procedimiento rápido y relativamente barato y accesible en la actualidad. Además, sería conveniente hacer un antibiograma con el/los microorganismos) aislados) para instaurar el tratamiento más adecuado. Posteriormente, sería aconsejable, a pesar de las limitaciones económicas y de tiempo, la caracterización de las cepas, al menos con respecto a la presencia de factores de virulencia, incluyendo la capacidad para formar biofilms.

4.2. Nuevos métodos de base molecular

En las últimas décadas,, el interés por el estudio de la micro biota asociada a distintas mucosas se ha visto reforzado con la aparición de técnicas moleculares que facilitan la caracterización y el seguimiento de una enorme variedad de grupos microbianos, incluyendo poblaciones no cultivables. Con estas nuevas herramientas se pueden llegar a conocer incluso los componentes individuales de los diversos grupos y su estado fisiológico de actividad. Mediante el análisis de secuencias del rDNA 16S amplificadas directamente de muestras biológicas humanas y su comparación con secuencias de especies cultivables, se ha estimado que sólo un 30% de las especies detectadas se corresponden con especies previamente aisladas e identificadas con las técnicas clásicas de cultivo.

4.2.1. Marcadores filogenéticos

Los marcadores filogenéticos son todos aquellos componentes de una célula capaces de proporcionar información sobre el grupo taxonómico al que pertenece (Familia, género, especie); entre ellos, se incluyen ciertos lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. El parámetro más importante para la aplicabilidad de una molécula como marcador filogenético es el número de residuos variables (y, en consecuencia, informativos) que contiene.

La utilidad del rRNA como marcador filogenético se puso de manifiesto durante la segunda mitad de los años 70 y, desde entonces, su aplicación en estudios sobre taxonomía y ecología microbiana ha crecido de forma exponencial. La fracción 16S del rRNA (1542 nucleótidos) es, con diferencia, el marcador más empleado para la identificación de bacterias y, entre las razones que justifican tal predilección, destacan las siguientes: (1) está presente en todas las células; (2) se detecta con facilidad; (3) posee numerosas regiones variables (con un total de 974 residuos variables para el dominio Bacteria); y (4) la existencia de un elevadísimo número de secuencias (> 100000) en las bases de datos (http://rdp.cme.msu.edu/html), que se corresponden con un amplísimo espectro de organismos, procedentes de los más variados ecosistemas. Por otra parte, la fracción 23S del rRNA (perteneciente a la subunidad mayor del rRNA) contiene 2904 nucleótidos, de los que aproximadamente 1970 son variables, por lo que puede utilizarse como un marcador adicional para el estudio filogenético de bacterias.

Sin embargo, el poder discriminatorio del 16S rRNA también tiene limitaciones. Más concretamente, su baja velocidad evolutiva hace que sea muy útil para distinguir poblaciones moderadamente divergentes pero no tanto cuando se trata de diferenciar poblaciones estrechamente relacionadas entre sí. En tales casos, el uso de secuencias de genes que codifican proteínas puede resultar más eficaz, especialmente en el caso de genes que, como gyrB (que codifica la subunidad B de la DNA girasa bacteriana), poseen una velocidad de transferencia horizontal baja y evolucionan con mayor rapidez que el rRNA. Otros marcadores interesantes son la región del espacio ínter génico 16S-23S rRNA, el gen infB (que codifica el factor 2 de iniciación de la traducción), la subunidad  de la ATP-asa y el factor de elongación Tu. En el futuro, la clasificación de las bacterias se basará en la combinación de dos o más marcadores filogenéticos que no estén relacionados entre sí, lo que, sin duda, aumentará nuestro conocimiento sobre la diversidad y complejidad de los ecosistemas bacterianos.

4.2.2. Análisis filogenético basado en la secuenciación del gen 16S rRNA

El empleo del 16S rRNA ha revolucionado la forma de identificar y clasificar taxonómicamente una bacteria ya que permite establecer relaciones filogenéticos objetivas entre distintos organismos. Las diferencias observadas cuando se comparan secuencias procedentes de distintas bacterias sirven para medir las distancias evolutivas y las relaciones se pueden presentar en forma de árboles filogenéticos. El hecho de que las moléculas de 16S rRNA contengan regiones con distinto grado de variabilidad (desde regiones muy conservadas hasta regiones muy variables) permite distinguir organismos a diferentes niveles filogenéticos (desde especie hasta dominio). Por otra parte, los cientos de miles de secuencias del gen 16S rDNA disponibles en la actualidad comprenden prácticamente todas las especies bacterianas descritas, con las que se pueden comparar rápidamente las secuencias que se obtengan en el laboratorio. Pero, además, la secuenciación del 16S rDNA también permite la detección de nuevas especies bacterianas, no descritas con anterioridad. De hecho, este enfoque ha permitido la detección, identificación y caracterización de una plétora de nuevas especies residentes en el las mucosas humanas y muchas otras están pendientes de confirmación.

Aunque la secuenciación del 16S rDNA de bacterias aisladas y cultivadas de forma tradicional está resultando muy útil para ampliar nuestro conocimiento sobre la diversidad microbiana, todavía existen muchos microorganismos que no pueden ser cultivados y que, en consecuencia, no pueden ser incluidos en un análisis microbiológico convencional. En los últimos años, la combinación de la PCR con la clonación de los fragmentos resultantes y la posterior secuenciación de los mismos, ha permitido un acceso directo a la diversidad filogenético bacteriana existente dentro de comunidades complejas. El empleo de cebadores universales, posibilita la amplificación simultánea de fragmentos del 16S rDNA de prácticamente cualquier microorganismo presente en una muestra sin necesidad de cultivarlos. Seguidamente, los distintos productos de PCR se clonan para formar una librería que incluya todos los fragmentos posibles, los cuales se pueden secuenciar y someter a un análisis filogenético. Lo más interesante es que, incluso en el caso de que una secuencia sea inédita, se puede determinar su posición en el árbol filogenético. Esta estrategia está demostrando ser particularmente útil para explorar la diversidad filogenético del micro biota de las mucosas humanas. Posiblemente, su utilidad aumente notablemente en el futuro cuando se introduzcan modificaciones que eviten el sesgo existente en la actualidad y que se debe fundamentalmente a los protocolos de extracción de ácidos nucleicos, que no permiten una lisis homogénea de todas las especies existentes en una muestra, a la forma de realizar la clonación de los amplicones y a los parámetros utilizados durante las reacciones de PCR.

4.2.3. DGGE y técnicas afines

Bajo este epígrafe se incluyen una serie de técnicas también conocidas como “de huella dactilar” (del inglés, fingerprinting) que se realizan tras una PCR previa y que, en general, se desarrollaron originalmente para la detección de mutaciones en genes. La más empleada en la actualidad es la técnica de electroforesis en geles con un gradiente de desnaturalización, universalmente conocida como DGGE (del inglés, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), y que fue introducida como una herramienta para el estudio de la diversidad de ecosistemas microbianos complejos por Muyzer et al. (1993). En este método, los fragmentos de 16S rDNA amplificados por PCR se separan en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente creciente de sustancias desnaturalizantes (urea o formamida). Durante la electroforesis, las dos hebras de cada uno de los amplicones empiezan a separarse (proceso que se conoce como fusión) en unas regiones concretas, de entre 25 y 300 PB, que reciben el nombre de dominios de fusión. Las variaciones de las secuencias dentro de esos dominios provocan que las temperaturas de fusión de los distintos amplicones sean diferentes. La migración a través de un gradiente de desnaturalización provoca un efecto similar al que ejercen las temperaturas de fusión, de manera que, entre fragmentos de un mismo tamaño, la separación de las cadenas es más difícil en los más ricos en CG y, en consecuencia, migran a una distancia mayor durante la electroforesis. Precisamente, la adición de un dominio rico en GC (de entre 30 y 50 bases) en el extremo 5’ de uno de los cebadores utilizados durante la amplificación previa permite la incorporación de una zona de fijación o anclaje en uno de los extremos de todos los amplicones, impidiendo la separación total de sus dos hebras. En principio, se pueden separar todos los amplicones que contengan diferencias en una única base y en cualquiera de las posiciones de las bases. Es decir, la DGGE permite la separación de moléculas de DNA que difieren en una sola base (Figura 1).

Tras la electroforesis, la tinción de los geles con bromuro de etidio, nitrato de plata u otros reactivos, como el SYBR-Green I, permite la visualización de los diferentes fragmentos formando la “huella dactilar” de la comunidad microbiana analizada. Aunque la tinción con nitrato de plata es la de mayor sensibilidad hay que tener en cuenta que, con este procedimiento, se tiñen también moléculas monocatenarias de DNA y que, además, los geles teñidos mediante esta técnica no se pueden utilizar para posteriores análisis mediante técnicas de hibridación.

El principio de la TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis) y la TTGE (Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis) es similar pero, en el primer caso, el gradiente de desnaturalización se sustituye por un gradiente de temperatura a lo largo del gel mientras que, en el segundo (en desuso en la actualidad), la temperatura de todo el gel aumenta progresivamente en función del tiempo.


Figura 1. Principio de la técnica de DGGE. Fuente: Temmerman (2003).

Las técnicas descritas en este apartado han facilitado el estudio de comunidades bacterianas pero también presentan una serie de limitaciones. En primer lugar, en la práctica únicamente permiten la detección de bacterias que se encuentren en concentraciones superiores al 1% en la comunidad microbiana (Muyzer et al., 1993; Zoetendal et al., 1998) y, por lo tanto, sólo las bacterias dominantes están representadas. No obstante, la utilización de cebadores específicos para determinados grupos o especies bacterianas y/o un formato de PCR en nido (en la que, tras una amplificación con cebadores universales, se amplifica un fragmento interno con cebadores específicos) pueden aumentar notablemente el límite de detección.

El principio de la técnica SSCP (del inglés, Single Strand Conformation Polymorphism) es diferente ya que se basa en la distinta movilidad electroforética de fragmentos de DNA monocatenario de tamaño similar dependiendo de su estructura secundaria. Esta técnica se ha utilizado en estudios sobre la diversidad y/o evolución de diversas comunidades bacterianas o fúngicas y posee prácticamente las mismas ventajas e inconvenientes que las anteriores. Por una parte, es capaz de detectar aquellas especies que estén presentes en concentraciones de al menos un 1.5% dentro de la comunidad microbiana, diferenciando el 99% de los fragmentos amplificados con un tamaño menor de 300 PB. Esta técnica no requiere la utilización del anclaje CG ni la creación de gradientes en los geles electroforéticos pero hay que tener en cuenta que una misma secuencia puede estar representada por más de una banda en un mismo gel.

La T-RFLP (del inglés, Terminal-Restriction Fragment Lenght Polymorphism) es una técnica molecular que permite el análisis de un número elevado de muestras en un espacio de tiempo relativamente breve. El principio de esta técnica es la amplificación del 16S rDNA de las bacterias existentes en una muestra, la posterior restricción enzimático de los distintos fragmentos obtenidos y la detección de los fragmentos terminales resultantes de la digestión. Para ello, uno de los cebadores se marca con fluorescencia, de manera que únicamente se pueden detectar los fragmentos terminales que contengan ese cebador, lo que simplifica la interpretación de los perfiles obtenidos. Teóricamente, los diferentes fragmentos terminales de restricción (TRF; del inglés, Terminal Restriction Fragment) se corresponden con distintas especies bacterianas dada la variabilidad de la secuencia del 16S rRNA. La identificación de los TRFs se realiza por comparación con las bases de datos disponibles en la red (http://www.cme.msu.edu/RDP/html) y/o por comparación con las librerías de clones construidas para la ocasión, aunque en ese último caso el análisis se enlentece notablemente. Este método ha sido utilizado en la caracterización de comunidades microbianas complejas de varios ecosistemas; de hecho, ya se ha anunciado la construcción de una base de datos para el análisis de aquellos TRFs obtenidos a partir de la micro biota del colon humano aunque será necesario que el número de enzimas de restricción utilizadas en la creación de los fragmentos depositados en las bases de datos aumente en el futuro.

Las técnicas anteriormente descritas, basadas en la amplificación por PCR del 16S rRNA, no ofrecen datos sobre el número real de bacterias presentes en las muestras. Sin embargo, es posible cuantificar 16S rRNA o rDNA mediante la utilización de una reacción de PCR. Entre estas técnicas se incluyen, la PCR competitiva, la PCR de número más probable y la PCR cuantitativa. Además, las técnicas de hibridación dot-blot y FISH son cuantitativas y no dependen de una reacción de amplificación por PCR. Por otro lado, se debe tener en cuenta que la cuantificación obtenida mediante la aplicación de estas técnicas es relativa. La cuantificación de los productos de PCR sólo representa el número relativo de ribosomas o genes correspondientes en una comunidad, y no la frecuencia relativa de las especies. La concentración del 16S rRNA y el número de ribosomas por célula depende del tipo y la actividad de la célula. Además, el tamaño del genoma y el número de copias de genes en el 16S rRNA difiere entre genomas bacterianos. Esto dificulta la extrapolación de los datos obtenidos a números de células.

4.2.4. Otras técnicas basadas en la PCR

La técnica RT-PCR competitiva es una variante de la PCR que se desarrolló para la obtención de copias de DNA complementario (cDNA) a partir de las correspondientes moléculas de RNA mensajero (mRNA) mediante la acción de una transcriptasa inversa, como la que utilizan los virus RNA para replicarse. En la RT-PCR competitiva, se añaden diluciones seriadas de un estándar interno (competidor) de concentración conocida a la muestra que contiene el DNA diana. El competidor y la secuencia diana comparten la zona de unión a los cebadores y los fragmentos derivados de la muestra se pueden diferenciar gracias a la incorporación de deleciones, inserciones o mutaciones en la secuencia del competidor.

La PCR de número más probable (MPN-PCR) se basa en el mismo principio que el sistema de recuento de bacterias del mismo nombre pero, en este caso, se utilizan diluciones seriadas del DNA extraído de las muestras y se aplican en una PCR con cebadores específicos. Se trata de una técnica rápida y eficaz para la cuantificación de la mayoría de los grupos bacterianos pero no discrimina al nivel de especie.

Actualmente, las técnicas de PCR están evolucionando hacia procedimientos más rápidos y automatizados en un solo tubo. Estos avances se basan en la utilización de compuestos fluorescentes y, teóricamente, presentan numerosas ventajas con respecto a los formatos anteriores. Por ejemplo, el tiempo necesario para obtener resultados se reduce al no requerir el análisis electroforético posterior de los productos de PCR. Además, al realizarse todo el proceso en el mismo tubo se reduce las posibilidades de contaminación y se facilita la automatización. En este sentido, los sistemas de PCR cuantitativo en tiempo real se caracterizan por detectar la amplificación de un producto de PCR durante el desarrollo de cada ciclo y no por medir la cantidad de producto de PCR generado tras un número determinado de ciclos. Es decir, proporciona en tiempo real un resultado no cualitativo sino numérico, que permite la cuantificación y el tratamiento estadístico de los datos obtenidos. Cuanto mayor sea el número inicial de copias del DNA diana antes se detectará un incremento en la fluorescencia como consecuencia de la progresiva acumulación de productos de PCR. En cada ciclo, las señales de fluorescencia se comparan con las producidas por un DNA estándar en el mismo experimento.

En los ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real se pueden emplear distintos tipos de sistemas de marcaje con fluorescencia, como las sondas TaqMan®, los cebadores scorpions®, las moléculas fluorescentes (molecular beacons), diversos colorantes (SYBR Green I; BEBO) o los cebadores fluorogénicos LUX. La utilización del método TaqMan y del colorante SYBR Green I para detección y cuantificación de comunidades microbianas del TGI humano ha sido ampliamente descrita. La instrumentación necesaria para la realización de esta técnica incluye un termociclador, un ordenador, un equipo óptico para la excitación de fluorescencia y la recepción de la señal de emisión, y un soporte informático para la adquisición y análisis de los datos. Actualmente existen varios sistemas disponibles que difieren en la capacidad de procesamiento de la muestra, el formato y el tipo de método de detección aplicable. Entre los más utilizados destacan los sistemas ABI PRISM SDS 7000 y SDS 7900HT (Applied Biosystems) y el sistema iCycler (BioRad). Finalmente, conviene señalar que actualmente los ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real son caros y no se encuentran optimizados para la mayoría de sus posibles aplicaciones aunque es de esperar que estas limitaciones tengan menor importancia en un futuro próximo.